2025年4月，湖南师范大学的研究团队在《Nucleic Acids Research》（IF=167）上发表了一篇题为“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”的文章。文章中，团队开发了一种基于CRISPR/Cas12a的单核苷酸变异(SNV)检测平台——HEPSD (high-energetic-penalty SNV detection platform)。该系统采用了二元crRNA结构设计，不仅能够激活Cas12a的切割活性，还通过非平衡杂交来放大单核苷酸的错配信号。

HEPSD在极端GC含量条件下对难以检测的SNV（包括摆动突变）显示出良好的区分能力，与传统的qPCR和二代测序（NGS）相比，在临床样本中也展现了100%的准确性。这一结果证明了HEPSD在临床分子诊断领域的潜力，同时其设计逻辑也可扩展至其他CRISPR系统。

研究背景

单核苷酸位点变异(SNVs)是常见遗传变异之一，与多种严重疾病（包括癌症和传染病）的发生密切相关。尽管有传统的SNV检测方法存在，但它们对特定类型SNV（如摆动碱基和高GC含量区域）往往无法有效应用。而CRISPR-Cas系统，尤其是Cas12a，虽然在核酸检测领域具有潜在的应用，但其在识别过程中的特异性提升机制仍未完全明了，对一些难以检测的SNV同样面临挑战。

研究结果

1. RNA/DNA二元探针的热力学分析

研究人员开发了由两个杂交臂组成的二元探针（BPs），通过选择性杂交区分SNVs。比较显示，BPs在比线性探针（LPs）更广泛的温度范围内依然表现出良好活性，并且在广泛的温度下BPs可以保持与突变目标的稳定结合状态。

2. 非平衡杂交驱动的SNV检测系统

基于BPs辅助的Cas12a系统，研究人员设计了二元CRISPR RNA（crRNA）结构并开发了HEPSD平台。分子动力学模拟和荧光分析表明，HEPSD对匹配目标形成稳定的三元复合物，而在错配情况下则显示不稳定性，从而有效抑制Cas12a的激活，验证了其良好的特异性。

3. HEPSD对难检测SNV的区分能力

在评估HEPSD的SNV检测性能时，发现其能够显著区分传统方法难以识别的SNV。这一平台在低GC和高GC背景下对于目标信号与错配信号的区分展现出极高的特异性，其检测限达到0.01%的突变等位基因频率，性能优越。

4. HEPSD分析临床相关突变

研究团队进一步评估了HEPSD在临床样本中对BRAFV600E和EGFRL858R突变的检测能力。在104例BRAFV600E和28例EGFRL858R样本中，HEPSD的敏感性和特异性均达到了100%，显示出其与定量PCR（qPCR）及下一代测序（NGS）结果的一致性，证明了该平台在实际临床应用中的潜力。

结论与展望

本文展示了通过创新性设计的二元CRISPR/Cas12a平台（HEPSD平台），该平台是利用非平衡杂交机制放大错配碱基的能罚差异，从而确保了超高特异性识别的实现。HEPSD在处理难以检测的SNV方面表现优异，特别是在GC含量较高的复杂区域。此外，HEPSD能够成功检测临床样本中的突变，准确率达到100%，显示其在临床分子诊断中的关键应用价值。未来，尊龙凯时还将持续致力于利用HEPSD平台推动癌症早诊和个性化治疗的发展，同时拓展其在其他CRISPR系统中的应用。