尊龙凯时细胞培养指南：有效管理细胞生长与传代的最佳实践

培养条件

细胞培养的气相应为95%空气和5%二氧化碳，最佳温度设置在37℃。推荐使用DMEM培养基，并添加10% FBS和1% P/S。A-673细胞系来源于一名15岁女性的横纹肌肉瘤，具有一定的生物学特性。这种细胞系能在软琼脂中形成克隆，并且能够在免疫抑制小鼠体内形成肿瘤。

细胞培养方法

传代方法首次建议以1:2的比例进行细胞传代。细胞采集后，应立即处理以维持生长状态，确保装瓶后用完全培养液灌满并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方式。收到细胞后，应用75%酒精喷洒整个细胞瓶，消毒后在超净操作台内进行严格的无菌操作。随后，将细胞瓶于37℃，5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态。

显微镜观察

在观察细胞生长情况时，建议拍摄不同倍数的照片（最佳为40x、100x和200x各一张）。前三天的照片将作为重要的售后依据，若未提供照片则默认细胞状态良好。

细胞传代步骤

a. 贴壁细胞传代

当细胞融合度未超过80%时，将培养瓶中的完全培养基收集至离心管中，保留5ml以进行后续培养。若细胞融合度已超过80%，则可进行传代。具体步骤如下：

1. 弃去顶部培养液，并用不含钙镁的PBS润洗1-2次。
2. 添加约1-2ml 0.25%胰蛋白酶消化液，在37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态，如大部分细胞变圆并脱落，迅速取出操作，加入5ml完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 将悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新鲜培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。

b. 悬浮细胞传代

悬浮细胞的传代步骤如下：

1. 应用半换液法处理，待培养瓶竖立于培养箱中静置1小时后，轻轻吸去3ml培养基，然后补充相同体积的完全培养基，必要时可直接添加500ul左右的FBS。
2. 如需分瓶，收集细胞悬液于离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养基重悬后按1:2的比例分至新T25瓶中，并添加6-8ml新鲜培养基以维持细胞活力。

细胞冻存与复苏

a. 细胞冻存

细胞达到80%汇合度时进行冻存：

1. 弃去培养基，用PBS洗涤。
2. 添加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，待细胞变圆后加5ml完全培养基终止消化，并转移至离心管。
3. 离心后弃去上清，加入1ml无血清冻存液，混匀后转入冻存管。
4. 冻存管放入-80℃冰箱，若后续转入液氮罐，则需在-80℃存放24小时以上。

b. 细胞复苏

解冻过程如下：

1. 迅速将冻存管置于37℃水浴中解冻，并用75%酒精擦拭外壁。
2. 转移细胞至含5ml完全培养基的离心管中，进行离心。
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬并接种于T25培养瓶。
4. 第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

注意事项

请注意，有些细胞在运输过程中可能会脱落，这属于正常现象。如脱落细胞较多，应将培养液收集至离心管中进行处理，并依照上述步骤进行后续操作。保持细胞健康的生长状态是尊龙凯时在细胞培养中的重中之重。